INSTITUTO NIDIAC
DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR PCR EN TIEMPO REAL
Dr. Rafael Franco Santillán, D. en C. Ernesto Prado Montes de Oca, LQ. Alejandra Núñez Zenteno.
Introducción
El avance en las técnicas de manipulación del material genético y el conocimiento cada vez más profundo del genoma humano nos conducen inexorablemente a un nuevo concepto de la Medicina, en el que el diagnóstico molecular desempeñará un papel central. Tras décadas de investigación básica, la comunidad científica ha caracterizado una serie de genes y proteínas implicados en el desarrollo de enfermedades multifactoriales (genes+ambiente) como el cáncer y la diabetes así como la detección inequívoca de agentes infecciosos. Los avances en la caracterización de estos marcadores biológicos y el desarrollo de métodos de diagnóstico molecular con mayor sensibilidad y especificidad mejoran la realización de un diagnóstico precoz, permiten monitorear el curso de la enfermedad durante el tratamiento, e incluso, en algunos casos, pueden proporcionar información pertinente a la hora de decidir entre diferentes opciones terapéuticas. Todo ello repercute de forma importante en el desarrollo de tratamientos más efectivos y en una alta calidad en la atención de pacientes con estas enfermedades.
Para proveer servicios de diagnóstico de calidad, el INSTITUTO NIDIAC ha establecido el Servicio de Diagnóstico Molecular que permite ofrecer a la comunidad clínica el resultado del esfuerzo investigador de este y otros centros de excelencia a largo del mundo. El Servicio de Diagnóstico Molecular del INSTITUTO NIDIAC se basa en ofrecer la posibilidad de realizar técnicas moleculares que no están habitualmente implantadas en los Hospitales del Sistema Nacional de Salud, como apoyo a los servicios clínicos de Centros Hospitalarios y Laboratorios de Diagnóstico. Cabe destacar que el Servicio de Diagnóstico Molecular del Instituto Nidiac dispone desde 2007 del certificado de calidad según la Norma ISO 9001:2000, asegurando así una mejor calidad en la prestación del servicio.
El Diagnóstico Molecular
La función del diagnóstico molecular es la detección de cambios en la secuencia o en la expresión de genes críticos en enfermedades humanas, mediante técnicas de biología molecular como purificación de ácidos nucleicos, retrotranscripción y PCR en Tiempo Real (PCR-tr). Mediante la técnica de PCR-tr se pueden realizar los siguientes tipos de ensayos
" Presencia/ausencia: para detección de patógenos y de secuencias únicas como alelo HLAB27, o la fusión de los genes BCR/ABL (leucemia mielógena crónica).
" Genotipificación de Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNPs): detectar variantes en enzimas como citocromos (p.ej. CYP2D6) que metabolizan fármacos, lo cual permite conocer la dosis efectiva que requiere un paciente o si es necesario administrarle otro como segunda opción (farmacogenómica) o para diagnosticar enfermedades mendelianas (un solo gen) como trombofilia hereditaria.
" Cuantificación relativa: comparar el aumento o la disminución en la expresión de un gen en determinada enfermedad como en cáncer (ej. TP53, BRCA1).
" Cuantificación absoluta: cargas virales o la amplificación en número de copias de un gen característico de un tumor maligno o metástasis (amplificación génica).
Para realizar su función el servicio de Diagnóstico Molecular cuenta con un equipo profesional con experiencia y altamente capacitado en las áreas de biología molecular. El Servicio de Diagnóstico Molecular del Instituto NIDIAC ofrece las siguientes pruebas y servicios:
Purificación de ácidos nucleicos. A partir de sangre periférica se puede obtener el DNA o el RNA de los linfocitos. Instituto Nidiac ofrece el servicio de purificación de ácidos nucleicos cuyos clientes potenciales son institutos de investigación y universidades, no obstante este servicio es abierto al público. El RNA obtenido es apto para Northern Blot, retrotranscripción y el DNA puede utilizarse para Southern Blot, vectores de clonación, secuenciación, PCR, etc.
Diagnóstico temprano de VIH (detección proviral). Las pruebas como ELISA que detecta anticuerpos del paciente o el Western Blot el cual detecta proteínas del virus, dependen de la respuesta inmune del paciente y/o de la pronta expresión del virus respectivamente, lo cual puede retardar el diagnóstico cuando no se monta una respuesta inmune o cuando la infección permanece latente. Mediante PCR-rt se puede detectar la inserción del genoma viral a pocos días del evento de riesgo.
Detección del alelo HLAB27. El gen del complejo principal de histocompatibiliad (MHC) codifica para el antígeno leucocitario humano y el grupo de alelos HLAB27 están fuertemente asociados a espondilitis anquilosante, una enfermedad que inicia con una inflamación en la columna vertebral y en estadíos avanzados lleva a la fusión de las vértebras, por lo cual la detección de esta secuencia se utiliza como diagnóstico de la enfermedad.
Pruebas a ofertar para el 2008:
Cargas virales de VIH: Detecta el número de copias de RNA mensajero (RNAm) del virus VIH-1 en pacientes seropositivos e indica si la terapia antiretroviral está funcionando o es necesario cambiarla. La disminución significativa del número de copias respecto a la última cuantificación es indicio de que se debe continuar con la terapia, en caso contrario modificarla inmediatamente.
Fusión de los genes BCR-ABL (cromosoma Filadelfia): la translocación t(9;22) o cromosoma de Filadelfia está presente en la mayoría de los casos (90-95%) de leucemia mielógena crónica (CML) y su presencia tiene importancia diagnóstica. Esta translocación también se encuentra presente en algunos casos de leucemia linfocítica aguda tipo pre-B, estando asociada con enfermedad agresiva y mal pronóstico. Técnica útil para el diagnóstico de leucemia mieloide crónica y determinación de enfermedad mínima residual después del tratamiento. En esta prueba se detecta la presencia y cuantificación de los niveles de expresión de las variantes de mRNA que codifican para las proteínas quiméricas p190 y p210 del gen fusión BCR-ABL.
Virus de Hepatitis B y C: son causa de hepatitis crónica, cirrosis, cáncer de hígado, insuficiencia hepática y eventualmente la muerte. Se transmiten por contacto sexual o por sangre contaminada. La detección temprana conduce a un mejor pronóstico si se trata adecuadamente.
Papilomavirus humano (PVH): es la detección de la presencia de los tipos 6, 11, 16, y 18 los cuales están asociados a cáncer cervicouterino (CCU) y enfermedades anogenitales. Debido a que la presencia del (los) virus antecede la transformación celular, mediante amplificación por rt-PCR se realiza la detección de manera más oportuna y es más sensible que el Papanicolau, el cual depende de una evaluación por microscopía hasta cierto punto subjetiva y por lo tanto más sujeta a errores. En México diariamente mueren aprox. 12 mujeres a causa de CCU y una detección temprana podría marcar la diferencia, ya que se puede dar un tratamiento antes de la aparición del cáncer.
Requisitos y Condiciones Generales de Envío de Muestras
La entrega a tiempo y la notificación del envío son esenciales. Por favor llame para anunciar con antelación los envíos de muestra y/o si necesita información adicional, por favor llame al teléfono 01-618-814-1075:
" DNA / RNA
" Se deben enviar al menos 10 L a 100 g/ml de DNA y/o RNA
" o La razón DNA/proteína o RNA/proteína debe ser mayor a 1.6
" o Las muestras de RNA deberán ser tratadas con DNAsa I para eliminar posible contaminación con DNA de lo contrario el costo de la prueba será mayor
" o Enviar muestras de RNA en nieve carbónica (-60º C) o si es DNA con geles refrigerantes
Sangre Periférica
" o Extraer las muestras en tubos de EDTA (color púrpura). La cantidad a enviar será de 5 ml de sangre periférica
" o Enviar las muestras a temperatura ambiente antes de las 6 horas de extracción.
" o En casos excepcionales, si el envío ha de realizarse al día siguiente mantener la muestra refrigerada y realizar el envío en hielo (4 ºC) y siempre dentro de las 16 horas posteriores a la extracción. NO CONGELAR.
" o La calidad y la exactitud de los resultados de las pruebas de laboratorio dependen altamente de la extracción apropiada, manejo y transporte de las muestras.
Las muestras deben ir acompañadas por una copia impresa del volante de petición debidamente cumplimentado, y enviadas a:
INSTITUTO NIDIAC, Laboratorio de Biología Molecular, Cobalto No. 2 Ciudad Industrial C.P. 34208, Durango, Dgo. México.
Las pautas siguientes ayudarán a asegurar la integridad de cada muestra recogida y remitida al INSTITUTO NIDIAC para su análisis:
Contenedores
Las muestras deben enviarse en contenedores adecuados que aseguren su integridad durante el transporte. El envío de muestras para diagnóstico debe cumplir el sistema de triple contenedor:
" La muestra debe incluirse en un contenedor primario que debe ser hermético y a prueba de rotura. Debe rotularse correctamente, señalando el tipo de muestra, la procedencia anatómica si es preciso, el nombre y apellidos del paciente, su número de identificación, y la fecha y hora de la toma. No deben incluirse elementos punzantes o cortantes (p. ej. agujas)
" El contendor primario debe ir envuelto en un protector físico adecuado a las condiciones de envío específicas del tipo de muestra.
o Bolsa de plástico para envíos en nieve carbónica
" El contendor primario debe incluirse en un contenedor secundario que podrá ser de cartón, plástico, etc., el cual debe rotularse correctamente con los datos del peticionario (remitente) y del destinatario (CNIO)
" Incluir el formulario de petición y el resto de la información que se considere necesaria.
Criterio para el Rechazo de Muestras
Las muestras serán inspeccionadas a su llegada para comprobar su adecuación a los requisitos especificados en este documento. El Servicio de Diagnóstico Molecular contactará al remitente, bien para corregir las deficiencias de información o en su caso descartar la muestra y solicitar una nueva.
Las causas más comunes de rechazo de muestras son las siguientes:
" Muestra inapropiada para el estudio requerido.
" Día y hora de extracción de muestra no especificada.
" Origen de la muestra sin especificar.
" Volante de petición ilegible o incorrectamente cumplimentado.
" Muestras de tejido fresco / fijado congeladas.
" Muestras no enviadas en las condiciones requeridas.
" Rotura de tubos / contenedores.
" Contaminación externa evidente.
" Sangre periférica coagulada.
" Volumen insuficiente. Si no hay suficiente para varias peticiones se pedirá al clínico que especifique la prioridad de las mismas.
Formulario de Petición
En el formulario de petición deben aparecer todos los datos necesarios para la identificación de la muestra y acompañada de información completa sobre el paciente, el espécimen y los estudios que se desean. Resumiendo, el formulario de petición debe incluir, con letra legible, la siguiente información:
Datos del Paciente
" Nombre
" Dos apellidos
" Edad o preferentemente, fecha de nacimiento
Datos del médico solicitante / peticionario:
" Nombre
" Dos apellidos
" Teléfono de Contacto
" Dirección a la que enviar el informe
" Correo electrónico
" Hospital / clínica de procedencia
" Servicio / Departamento
Datos de la Muestra
" Tipo de muestra
" Lugar anatómico de procedencia de las muestras.
" Fecha y hora de la toma.
" Determinación(es) solicitada(s)
Datos Clínicos
" Diagnóstico (no utilizar siglas)
" Otros datos clínicos de interés
" Tratamiento que el paciente está recibiendo (especificar si no lo está recibiendo).
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